背景

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又称内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，可作用于膜受体激活多种细胞（巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等）信号转导系统，促进促炎细胞因子和其他炎性介质的合成及释放，引发炎症反应?？突Р捎肔PS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。

材料与方法

1.1?栖菜多酚的制备

取?燥?栖菜粉末，加?体积分数60%?醇溶液，使?SCIENTZ-IID超声辅助浸提（料液?1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽滤后真空减压蒸馏去除?醇，获?栖菜粗多酚溶液，依次采?等体积?油醚、?酸?酯分级萃取，真空减压蒸馏后冻?（使?SCIENTZ-12N过夜冻?），获得HFPs粉末。测得HFPs粉末总酚含量为23.67±0.24 mg/g。利??菌?配制成多酚?液，再以细胞培养液稀释?不同浓度，?于后续实验。

1.2 炎症细胞培养

使?完全培养基（含10%（体积分数，下同）胎??清和1%?链霉素双抗DMEM培养基）培养RAW264.7细胞，37 ℃、5% CO2培养，细胞融合度约80%时进?传代。然后分成3组进?培养：①阴性对照组，仅加?含10%胎??清的DMEM培养基；②LPS阳性对照组，加?含LPS（1μg/mL）和10%胎??清的DMEM培养基刺激24 h；③HFPs+LPS组，经含不同质量浓度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎??清的DMEM培养基培养24    h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎??清的DMEM培养基刺激24h。

1.3 RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，?0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2 次，每孔加?500 μL TRIzol试剂，使?SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取总RNA，超声参数为：100 W，1 s 开1 s关，共1 min，并将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采?SYBR Green嵌合荧光法与引物进?实时荧光定量PCR。测定?的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和内参基因次?嘌呤磷酸核糖基转移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采?2－ΔΔCt法计算?的基因的相对表达量。

1.4 MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋?相对表达量测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，?0.01 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2 次，加?200 μL RIPA细胞裂解液，使?SCIENTZ-IID加速破碎细胞协助提取蛋?质，超声参数为：100 W，1 s 开1 s关，共1 min，离?（12000 r/min、4 ℃）10 min取上清液。采?BCA蛋?质量浓度测定试剂盒测定各组蛋?浓度，?蛋?上样缓冲液调整蛋?质量浓度为2 mg/mL，95 ℃加热10 min使蛋?变性然后进???烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝?电泳分离；湿转到聚偏?氟?烯膜；5%（质量分数）脱脂奶粉（TBST溶液配制）封闭1 h；?抗4 ℃孵育12 h；?抗室温孵育2 h；加?ECL试剂进?显?反应，测定蛋?条带灰度值。以β-actin为内参，?的蛋?包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和pJNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表?相应蛋?磷酸化?平。

结果与分析

01.RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定结果

采?实时荧光定量PCR测定HFPs对LPS诱导的巨噬细胞中重要促炎细胞因?IL-1β、IL-6和接触式超声在胞内蛋?及核酸提取过程中的应?TNF-α基因相对表达量，以及炎症相关酶COX-2基因相对表达量的影响。如图1所?，LPS刺激不同时间后，所有炎症介质的mRNA表达?平均显著提?（P＜0.05）。HFPs对促炎细胞因?的抑制作?与其剂量、LPS诱导时间及细胞因?种类相关。与LPS组相?，静息状态细胞经HFPs处理再经LPS诱导12、24 h后，IL-1β和IL-6的基因相对表达量显著下降；HFPs显著抑制LPS诱导3 h后TNF-α基因的相对表达，?在LPS诱导6?24 h的抑制作?总体不明显。在LPS诱导24 h，较低剂量HFPs（30、60 μg/mL）预处理对COX-2基因表达具有显著抑制作?，但提?剂量后该抑制效果消失，甚?出现反向促进作?，120 μg/mL HFPs预处理促使COX-2相对表达量较LPS组显著上升（P＜0.05）。

02.MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋?相对表达量测定结果

采?蛋?免疫印迹法测定巨噬细胞中MAPKs和NF-κB信号通路关键蛋?的磷酸化?平。如图2所?，与阴性对照组相?，LPS刺激3 h后细胞中p38、JNK和p65蛋?的磷酸化?平显著升?（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs预处理对LPS诱导的巨噬细胞中p38和p65的磷酸化产?显著抑制作?（P＜0.05），且呈?定的剂量依赖性，但对JNK的磷酸化没有显著影响，表明HFPs的抗炎作?可能与其靶向作?于p38 MAPK和NF-κB p65有关。

总结

客户采?LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建?体外炎症模型，使?超声波细胞粉碎机将蛋?及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋?相对表达?平??评估?栖菜多酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利?提供理论依据。超声波细胞粉碎机在整个实验中起到作?如下：

1. 辅助提取?栖菜中多酚组分，加速多酚组分释放，缩短了提取进程，后续通过冻?步骤即可获得?栖菜多酚粉末，溶解后备?；

2. 搭配TRIzol试剂对细胞中总RNA进?提取，试剂中含有苯酚，可加速细胞破碎和核酸释放，还加?核酸酶抑制物质防?RNA降解，PCR结果表明提取的RNA浓度与纯度较好，可?于相关基因表达情况的分析；

3. 搭配RIPA裂解液对细胞中的蛋?质进?提取，?幅减少原本冰上裂解所需时间（30 min），试剂中含有的蛋?酶抑制剂可防?蛋?降解，还含有磷酸酶抑制剂，防?蛋?提取后的再修饰，更好测定蛋?磷酸化状态。